在復(fù)性過程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是由堿基互補(bǔ)配對(duì)原理完成的。CR需要模板和酶，每一次循環(huán)都需要。酶的數(shù)量是固定的，但模板在每一次的延伸就一次用完就沒了。PCR反應(yīng)參數(shù)包括變性溫度和時(shí)間、復(fù)性溫度和時(shí)間、延伸溫度和時(shí)間、循環(huán)數(shù)四方面，在PCR反應(yīng)過程中都發(fā)揮著至關(guān)重要作用。
循環(huán)次數(shù)過多，并不會(huì)計(jì)產(chǎn)物也隨之過度增加。因?yàn)樵俅窝h(huán)都有高溫到低的溫度變化，聚合酶的活性有限，而且一般體系中引物和原料的量也不會(huì)是無限供應(yīng)的。
另外循環(huán)次數(shù)過多，產(chǎn)物間可能會(huì)形成較為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，影響其作為模板的效率，因此循環(huán)次數(shù)不是越多越好，一般PCR反應(yīng)的循環(huán)不超過35次。
PCR循環(huán)數(shù)通常約為 30 個(gè)，循環(huán)次數(shù)過多，雖然可以在一定程度上增加產(chǎn)品的數(shù)量，但由于反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，一些非特異性產(chǎn)品的擴(kuò)增也會(huì)相應(yīng)增加，并且隨著酶擴(kuò)增能力的降低，合成靶片段的能力也會(huì)降低，這也可能引起其他非特異性擴(kuò)增。
DNTP也將被消耗，如果一個(gè)dNTP消耗很多，后續(xù)的擴(kuò)增將不可避免地導(dǎo)致不匹配。因此，如果產(chǎn)品足夠用于后續(xù)分析，循環(huán)時(shí)間將不會(huì)過度延長(zhǎng)。在選定的變性溫度下，DNA分子越長(zhǎng)，完全分離兩條鏈所需的時(shí)間就越長(zhǎng)。如果變性溫度太低或時(shí)間太短。
通常只有模板DNA中富含AT的區(qū)域被變性，在PCR的第一個(gè)周期中，有時(shí)變性時(shí)間通常設(shè)計(jì)為 5 min，以增加大分子模板DNA也稱為預(yù)變性完全變性的可能性。當(dāng)模板DNA的G ＋ C含量超過 55％ 時(shí)，需要更高的變性溫度，源自古細(xì)菌的DNA聚合酶比TaqDNA聚合酶對(duì)高溫的抵抗力更高。
因此，它更適合擴(kuò)增富含GC的DNA模板，復(fù)性過程中使用的溫度比如：I．E．退火 是至關(guān)重要的，如果復(fù)性溫度過高，寡核苷酸引物不能用模板很好地復(fù)性，擴(kuò)增效率將非常低。從這個(gè)角度來看，絕大多數(shù)擴(kuò)增產(chǎn)品應(yīng)該是特異性擴(kuò)增產(chǎn)品，而非特異性擴(kuò)增產(chǎn)品太低而無法檢測(cè)。
可可.jpg)
